Use of patient-derived tumor stem cells to identify potential therapeutic targets that determine the invasive capacity of high-grade gliomas

Resumen

El glioblastoma (GBM) es el tumor primario maligno más común y letal del sistema nervioso central y, a pesar de décadas de investigación, el pronóstico de los pacientes con GBM no ha mejorado sustancialmente. La dificultad para desarrollar tratamientos más efectivos se adjudica, en parte, a la presencia de células madre tumorales (CMT). Estas células son capaces de resistir a las terapias antineoplásicas, pudiendo regenerar el tumor luego de su resección. El carácter difuso de los GBM es otro factor que dificulta el desarrollo de terapias efectivas. Estos tumores no tienen bordes histológicamente claros y definidos. En la periferia, las células tumorales se encuentran invadiendo el parénquima cerebral normal. Esta habilidad para invadir imposibilita la resección total del tumor mediante cirugía y conlleva la generación de nuevos focos tumorales. A pesar del rol central de la migración e invasión celular en la progresión y la recurrencia del GBM, no se han desarrollado tratamientos que tengan como blanco estos procesos. Más aún, algunos tratamientos incluso son capaces de aumentar la capacidad invasiva de estas neoplasias. Teniendo en cuenta estas consideraciones, se propuso como objetivo general de esta tesis estudiar la capacidad migratoria e invasiva de las CMG. Para ello, dada la heterogeneidad inter-tumoral que presentan los GBM, se utilizaron varias líneas de CMG derivadas de pacientes con el fin de identificar posibles blancos terapéuticos que afecten estos procesos biológicos. A lo largo de este trabajo se evaluó la capacidad migratoria e invasiva de las líneas de CMG, tanto en condiciones basales de cultivo (normoxia), como en respuesta a hipoxia (1% O2 durante 72 horas), ya que la hipoxia es un inductor conocido de la migración e invasión en GBM. Los ensayos de migración in vitro revelaron una elevada variabilidad entre las distintas líneas de CMG. Se observó que algunas de ellas exhiben una capacidad migratoria de hasta cinco veces mayor que la de otras. Además, encontramos que, en respuesta a hipoxia, cinco de las ocho líneas analizadas aumentan su capacidad migratoria, una no se ve afectada y, llamativamente, otras dos la disminuyen. Respecto a la capacidad de invasión, no se observó una relación directa entre la invasión y la migración. Por ejemplo, una línea de CMG presentó la menor capacidad migratoria, pero a su vez, exhibió la mayor capacidad invasiva. Con el fin de comprender la variabilidad en la migración/invasión entre las líneas tumorales, se realizó una secuenciación masiva del transcriptoma, tanto en normoxia como en hipoxia en cuatro líneas de CMG. La secuenciación permitió analizar la heterogeneidad entre estas líneas en cuanto a la expresión diferencial de genes y el enriquecimiento de conjuntos de genes asociados a procesos biológicos o a factores de transcripción. Con estos análisis se confeccionó un listado con numerosos posibles blancos terapéuticos. De esta selección inicial de genes, se priorizaron aquellos que mostraron una elevada expresión y una baja variabilidad entre réplicas. De acuerdo con estos criterios, se eligieron seis genes candidatos para ser evaluados en profundidad: HIF1α, HIF2α, fibronectina 1 (FN1), condroitínsulfato proteoglicano 5 (CSPG5), y las galectinas 1 y 3 (LGAS1 y LGALS3). Para evaluar la relevancia de HIF1α y HIF2α en la capacidad migratoria e invasiva de CMG, llevamos a cabo los silenciamientos génicos de los mismos utilizando ARN pequeños de interferencia (siRNA) y, posteriormente, realizamos ensayos de migración e invasión in vitro. En todas las líneas de CMG pudimos observar que HIF1α y/o HIF2α afectan la migración. Sorprendentemente, en algunas líneas de CMG el silenciamiento de estos factores de transcripción condujo a la inhibición de la migración, mientras que, en otras, a un incremento de esta. De manera similar, el silenciamiento de CSPG5 también genero efectos variables entre las líneas de CMG, ya que su silenciamiento llevo a un aumento de la migración sólo en dos de las líneas de CMG estudiadas. Al silenciar FN1 se observó que su silenciamiento llevaba a un aumento de la migración en dos líneas. El rol de FN1 en la migración también se evaluó agregando concentraciones definidas de esta proteína a los componentes de la matriz extracelular empleada como sustrato en los ensayos migratorios. Pudimos observar que bajas concentraciones de fibronectina recombinante aumentan la migración de las CMG, mientras que concentraciones mayores la inhiben. Cabe resaltar que este efecto dual se observó en todas las líneas de CMG. El efecto del silenciamiento de LGALS1 sobre la migración fue homogéneo en todas las líneas de CMG ensayadas, la disminución de su expresión conllevó una menor capacidad migratoria. El silenciamiento de LGALS3, en cambio, disminuyó la migración en todas las líneas exceptuando una. Por último, se evaluó si las líneas de CMG que exhibieron una baja capacidad migratoria en normoxia e hipoxia, son capaces de aumentar su migración frente a otros estímulos. Para ello, se evaluó el efecto de medios condicionados en la capacidad migratoria de las líneas CMG. En particular, se evaluaron dos tipos de medios condicionados medio condicionado por macrófagos y medio condicionado por la misma línea de CMG. Se observó que una de las líneas de CMG con baja migración basal cuya capacidad migratoria e invasora disminuye con la hipoxia, aumenta notablemente su migración con medios condicionados. Este resultado evidencia que la baja migración de esta línea, no se debe a una inhabilidad para migrar sino a la falta de estímulos externos precisos. En conclusión, en esta tesis se lograron identificar numerosos genes que podrían representar posibles blancos terapéuticos para interferir en la invasión del GBM, en particular, la invasión en respuesta a la hipoxia. Sin embargo, los resultados obtenidos resultaron muy variables entre las líneas celulares estudiadas, recalcando la importancia de considerar la heterogeneidad inter-tumoral a la hora de desarrollar terapias.