Estudio de la migración de precursores mesenqulmales. Estrategia para la mejora de sus propiedades migratorias

Resumen

espanolLas celulas madre mesenquimales (MSCs, del ingles mesenchymal stem cells) presentan unas propiedades prometedoras para poder ser usadas en terapia celular. Son capaces de migrar, diferenciarse, secretar factores solubles, inmunomodular las respuestas del sistema inmune y son consideradas hipoinmunogenicas.Estas propiedades las convierten en buenas candidatas para el tratamiento de una gran diversidad de enfermedades o trastornos. A pesar de los grandes avances en el campo y la utilizacion de MSCs en ensayos clinicos se desconoce todavia mucha informacion acerca de la biologla de estas celulas. Para el exito de la terapia, las celulas suministradas tienen que alcanzar el tejido danado o afectado e integrarse en el para poder ejercer su funcion. Sin embargo, la eficacia en la llegada y permanencia de las celulas en el tejido diana sigue presentando un gran reto. Con el objetivo de conocer mejor la migracion de los precursores mesenquimales (MPs, del ingles mesenchymal precursors) obtuvimos celulas de distintos tejidos. Los resultados mostraron que los MPs presentaban blebs dinamicas de manera espontanea cuando se encontraban en subconfluencia en cultivo. Cuando las celulas no estaban adheridas y tenian forma redondeada las blebs estaban generalizadas por la membrana plasmatica, mientras que cuando las celulas se adherian y adquirian forma elongada, estas estructuras se disponian polarizadas en los frentes de avance en combinacion con los lamelipodios. Comprobamos que la F-actina, RhoA y las proteinas del grupo ERM (ezrina, radixina y moesina; unen los filamentos de actina con la membrana plasmatica) formaban parte de su estructura. Las blebs se veian afectadas por la adherencia al sustrato y se inhibia su formacion al al'1adir blebbistatin. Los ensayos de migracion mostraron una correlacion entre la capacidad de migracion de los MPs y el porcentaje de blebs que presentaban. Ademas, la migracion disminuia significativamente cuando se anadia blebbistatin en el cultivo. Se propuso como estrategia para mejorar la capacidad de migracion de los MPs la aplicacion de ultrasonidos (US) terapeuticos empleando la minima intensidad del dispositivo. La estimulacion de las celulas no afecto ni a su viabilidad ni a la capacidad de proliferacion. No se produjeron cambios en la morfologia, ni en las agrupaciones de las celulas, asi como no hubo cambios detectables a nivel del citoesqueleto. Las capacidades de las celulas de migrar e invadir tambien se mantuvieron constantes a pesar del tratamiento. Finalmente, no se detectaron variaciones en la expresion genica de los genes ROCK1, integrina 1. laminina 1. colageno tipo I y factor de crecimiento transformante 1. previamente involucrados en la estimulacion con US. Tomando en conjunto los resultados serla conveniente continuar con el estudio del papel de las blebs en entornos 3D e in vivo, asi como investigar la aplicacion de US utilizando variaciones de los parametros empleados. EnglishABSTRACT: Mesenchymal stem cells (MSCs) have promising properties for applicalions in cell therapy. They are capable of migrating, differenliating, and secreting soluble factors, and they also have immunomodulatory effects and are considered hypoimmunogenic. The combination ofthese properties makes them good candidates for the treatment of a wide range of diseases. Despite great advances in the field and their use in clinical trials, much information about the biology of these MSCs is slill lacking. For the success of MSC therapy, the cells mus! reach the damaged !argel tissue and engraft, to accomplish their reparative function. However, the effecliveness of the delivery of the cells to !argel organs, and their permanence, remains a major challenge. With !he intenlion of developing a richer understanding of the migratory capacity of mesenchymal precursors (MPs), we obtained cells from different lissues and tested their migration in vitro. The results showed that MPs spontaneously develop dynamic blebs in culture. When the cells were unattached and had a rounded shape, blebs were generalized around the plasma membrane . By contras!, when the cells adhered, they acquired an elongated shape, and bleb structures became polarized on the leading edge of the cells in combinalion with lamellipodia. We found that blebs were rich in F-aclin, RhoA and ERM proteins (ezrin, radixin and moesin; crosslink actin filaments with plasma membrane). Blebs were affected by adhesion to the substrate and their formalion was inhibited by the addition of blebbistatin. Migration assays showed a correlalion between the migration capacity of MPs and the number of blebs they developed. Moreover, migration decreased significantly when blebbistalin was added. The application of therapeulic ultrasound (US) al low intensilies has been proposed as a strategy to improve the migralion capacity of MPs. The stimulation of the cells with US did not affect their viability or proliferation capacity. Furthermore, there were no changes in morphology or cell groupings and no detectable changes al the cytoskeleton level. The ability of the cells to migrate and invade also remained constan! despite the US treatment. Finally, no variations in !he level of gene expression, of genes previously involved in stimulation with US, were detected for ROCK1, integrin 131, laminin 131, type I collagen and transforming growth factor 131. Considering !he results as a whole, il would be interesling to continue studying the role of the blebs in 30 cultures and also in in vivo migralion, as well as to investigate the potential application of US using variations of the tested parameters.